Чиста культура на агарі: живильні середовища, чашки Петрі та скошений агар

Отриману культуру спершу переносять на агаризоване живильне середовище в чашках Петрі. На агарі видно все, що важливо на старті: чи культура чиста, як швидко росте колонія і який вигляд має міцелій. Лише після цієї перевірки культуру розмножують і закладають на зберігання — на скошеному агарі в пробірках.

Ця стаття продовжує матеріал про пошук штаму й описує чотири речі: вибір живильного середовища, приготування агару, пересів на чашки та підготовку культури до зберігання. Наприкінці — додаток із народними рецептами грибників: агар із мальт-екстракту, картопляних пластівців, меду чи сухого корму.

Живильні середовища

Для старту достатньо двох середовищ: картопляно-глюкозного агару (PDA) і мальт-екстрактного агару (MEA). На них їжовик гребінчастий (Hericium erinaceus) у більшості порівняльних дослідів росте найкраще, але оптимум залежить від штаму.

Дані щодо кислотності суперечливі. Оптимальний pH для різних штамів становив 4–4,5 (Gonkhom et al., 2022), 6 (Imtiaj et al., 2008) і 7 (Diskit et al., 2024). Тому новий штам варто висіяти одразу на два-три середовища й порівняти швидкість росту та вигляд колонії.

Рецептури на 1 л

Усі середовища після приготування стерилізують 15 хвилин за 121 °C. Кількості наведено на 1 л дистильованої води; сусло-агар готують на суслі замість води.

Для їжовика до сусло-агару додавали 3 % дубової тирси та 5 % ялицевої хвої (Suleimenova et al., 2025).

Підготовка агару

Агар готують у шість кроків; ключові параметри — стерилізація 15 хвилин за 121 °C і розлив за 45–50 °C.

1. Зважте компоненти й розмішайте їх у воді за рецептурою.
2. Доведіть pH до потрібного значення ще перед стерилізацією (DSMZ, середовище 90).
3. Стерилізуйте середовище в автоклаві 15 хвилин за 121 °C (Merck, PDA).
4. Охолодіть розплавлений агар до 45–50 °C: так на кришках утворюється менше конденсату.
5. Розлийте по 15–20 мл на чашку 100 × 15 мм — вийде шар завтовшки близько 0,3 см. Розливайте в стерильних умовах.
6. Підсушіть застиглі чашки близько 24 годин за кімнатної температури. Далі їх зберігають у холодильнику в закритих пакетах, а перед роботою прогрівають до кімнатної температури.

Параметри кроків 4–6 взято з протоколу Американського товариства мікробіології (Wise, 2006). Він написаний для бактеріологічних чашок, але техніка розливу агару та сама.

Перенесення культури на чашки Петрі

Отриману культуру пересівають на свіже середовище якнайшвидше, зазвичай протягом 1–2 тижнів. Техніку нижче описано в настановах Університету штату Пенсильванія для культур печериці (Royse & Wilkinson); температуру й строки наведено для їжовика.

1. Працюйте в стерильних умовах. Інструмент прожарюйте в полум'ї й охолоджуйте перед кожним пересівом.
2. Виріжте шматочок агару з міцелієм розміром не більше ніж 3 × 3 мм.
3. Беріть матеріал із кількох ділянок колонії, але не з центру, де лежить вихідний шматочок інокулюму.
4. Покладіть шматочок у центр чашки й підпишіть її: штам, середовище, дата, номер пересіву.
5. Не закривайте культуру герметично. Міцелію потрібен вільний газообмін, тому чашки й пробірки не тримають у замкненій системі.
6. Інкубуйте за 25 °C. Це оптимум для міцелію H. erinaceus; ріст спостерігали в межах 20–30 °C (Imtiaj et al., 2008).
7. Оглядайте чашки щотижня: однорідність росту, сектори, контамінація. Міцелій із секторів не розмножуйте: це може вплинути на продуктивність культури.

Орієнтир за строками: на PDA ріст починався через 4 доби після посіву, а чашка повністю заростала на 15-ту добу (Singh et al., 2021).

Скошений агар

Скошений агар — це пробірка з живильним середовищем, яке застигло під нахилом. У пробірці середовище висихає повільніше, ніж у чашці, а вузьке горло зменшує ризик контамінації, тому саме так тримають культури між пересівами.

1. Розлийте середовище в пробірки до стерилізації. На стандартну пробірку 20 × 150 мм беруть 14 мл замість 10 мл: більший об'єм менше висихає (Royse & Wilkinson).
2. Закрийте пробірки пробками, що пропускають повітря, і стерилізуйте 15 хвилин за 121 °C.
3. Покладіть гарячі пробірки під нахилом і залиште до застигання. Агар не має торкатися пробки.
4. Пересійте культуру шматочком не більше ніж 3 × 3 мм із перевіреної чистої чашки.
5. Інкубуйте за 25 °C, доки міцелій не вкриє скіс, і лише тоді переносьте пробірки в холод.

Середовище для скосів беруть те саме, що й для чашок. У колекціях базидіоміцетів для цього використовували 1,5 % мальт-екстрактний агар (Burdsall et al., 1994) і PDA (Ryu et al., 2011).

Підготовка до зберігання

Робочий запас культури зберігають на скошеному агарі за температури близько 4 °C і періодично пересівають. Так працює й колекція IBK Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного: 4 ± 1 °C, регулярні пересіви та мікроскопічний контроль (опис колекції на GBIF).

Чотири правила підготовки:

• Закладайте кілька пробірок одразу. Частина лишається недоторканим вихідним запасом, решта — робочі, з яких беруть матеріал для пересівів.
• Підписуйте кожну пробірку: вид, номер штаму, середовище, дата й номер пересіву.
• Не заморожуйте культуру на агарі. Без кріопротектора заморожування може пошкодити або вбити міцелій (Royse & Wilkinson).
• Не закривайте пробірки герметично: культурі потрібен газообмін і під час зберігання.

Строки між пересівами залежать від виду й умов. Для культур печериці настанови радять зберігати їх за 4 °C до 4 місяців, а без холодильника пересівати щонайменше кожні 60 днів (Royse & Wilkinson). У колекції дереворуйнівних грибів усі культури на скосах пересівали раз на рік (Burdsall et al., 1994). На скосах PDA за низької температури життєздатними лишалися 94–96 % штамів базидіоміцетів через 2–5 років і 82 % через 7 років (Ryu et al., 2011).

Життєздатність, однак, не означає незмінність. Що довше культура безперервно росте й що частіше її пересівають, то вища ймовірність генетичних і фізіологічних змін (Homolka, 2014). Тому для тривалого зберігання колекції використовують методи, за яких міцелій майже не росте.

Порівняння двох підходів на 14 ізолятах дереворуйнівних грибів за 18 років не виявило різниці в 12 випадках: щорічні пересіви на скосах і зберігання у воді дали однакову здатність руйнувати деревину (Richter et al., 2010). Після будь-якого зберігання культуру перевіряють так само, як щойно отриману: чистота, швидкість росту, вигляд колонії.

Наведені дані отримано на інших видах базидіоміцетів. Окремих досліджень тривалого зберігання H. erinaceus серед цих джерел немає, тому строки для власного штаму треба перевірити на практиці.

Порядок дій

1. Приготуйте PDA або мальт-екстрактний агар і стерилізуйте 15 хвилин за 121 °C.
2. Розлийте охолоджений до 45–50 °C агар по 15–20 мл на чашку й підсушіть чашки.
3. Пересійте отриману культуру шматочками до 3 × 3 мм на кілька чашок.
4. Інкубуйте за 25 °C і щотижня перевіряйте чистоту, швидкість росту та однорідність колонії.
5. Із найкращої чистої чашки пересійте культуру на кілька пробірок зі скошеним агаром.
6. Після заростання підпишіть пробірки й перенесіть у холодильник за температури близько 4 °C.
7. Частину пробірок залиште недоторканою як вихідний запас, з рештою працюйте.

Як із чистої чашки приготувати рідку культуру й перевірити її перед роботою — у статті про рідку культуру.

Додаток: народні рецепти грибників

Грибники-аматори готують агар із того, що можна купити в пивоварному чи продуктовому магазині: світлого мальт-екстракту, картопляних пластівців, меду, харчових дріжджів і навіть сухого корму для собак. Стандарт у них один: 20 г агару і близько 20 г живильної основи на 1 л води, стерилізація в скороварці.

Рецепти зібрано з форумів грибників і сайтів гроверів; усі кількості перераховано на 1 л води. Це практика аматорів, а не перевірені дослідженнями протоколи: склад корму чи меду не стандартизований, тому результат від партії до партії може різнитися.

Базові рецепти

Найпоширеніше середовище — агар на світлому мальт-екстракті (LME): 20 г екстракту й 20 г агару на 1 л. Усі кількості в таблиці наведено на 1 л води.

Середовища з підручних продуктів

Мальт-екстракт у цих рецептах замінюють кормом, борошном або відваром зерна. Окрема група — бідні середовища, на яких культуру зберігають.

Добавки

Добавки вносять у будь-який базовий рецепт; кількості наведено на 1 л середовища.

За порадами з форумів, джерел вуглецю в середовищі має бути не більше ніж 4 %, джерел азоту — не більше ніж 0,5 %, а pH для більшості грибів — 5–6. Грибники на форумах додають два спостереження: на біднішому середовищі міцелій розростається швидше, а чергування середовищ між пересівами, наприклад MEA і PDA, пожвавлює ріст.

Як готують без автоклава

Автоклав замінюють скороваркою на 15 psi (близько 1 бар надлишкового тиску, що відповідає приблизно 121 °C); час стерилізації в різних джерелах — від 15 до 45 хвилин.

1. Змішайте компоненти з водою в пляшці, удвічі більшій за об'єм середовища (Mycology Men).
2. Стерилізуйте в скороварці за 15 psi: щонайменше 15 хвилин (EZMushroom), 30 хвилин (Mycology Men) або 45 хвилин (Simply Horticulture).
3. Охолодіть до 46–55 °C і розливайте: агар лишається рідким приблизно до 42 °C (Mycologyst; Mycology Men).
4. Лийте по 20–25 мл на чашку: з 1 л виходить близько 40 чашок.
5. Дайте застигнути близько 30 хвилин за кімнатної температури.
6. Зберігайте чашки в холодильнику дном догори — так менше конденсату; термін — кілька місяців (Mycology Men).

Є й спосіб без розливу після стерилізації: середовище доводять до кипіння, розливають у чашки, загортають у фольгу й лише тоді стерилізують 30 хвилин за 15 psi. Рецепт для цього способу з форуму на 120 мл води: 3 г картопляних пластівців, 1 г меду або цукру, 2 г агару — цього вистачає на 8–10 чашок. Для такого способу підходять лише скляні або термостійкі чашки: звичайні полістиролові в скороварці деформуються.

Джерела

1. Singh J. et al. (2021). Efficacy of different culture media on growth and characteristics of mycelium of monkey head mushroom (Hericium erinaceus). Plant Disease Research, 36(1).
2. Suleimenova Z., Lomberg M., Bisko N. et al. (2025). Hericium erinaceus: Combining traditional uses with modern biotechnology to develop nutraceuticals. Biosystems Diversity, 33(3), e2535.
3. Jahedi A. et al. (2023). Revival of wild edible-medicinal mushroom (Hericium erinaceus) based on organic agro-industrial waste. Scientia Horticulturae, 323, 112510.
4. Gonkhom D. et al. (2022). Optimal conditions for mycelial growth of medicinal mushrooms belonging to the genus Hericium. Mycological Progress, 21, 82. Склад середовищ — у таблиці 2 повного тексту.
5. Ahmad L. et al. (2025). Effect of Different Nutrient Media on Mycelial Growth of Different Species of Medicinal Mushroom. Arab American University Journal, 11(1).
6. Imtiaj A. et al. (2008). Vegetative Growth of Four Strains of Hericium erinaceus Collected from Different Habitats. Mycobiology, 36(2), 88–92.
7. Diskit S. et al. (2024). Optimization of Mycelial Growth Parameters in Lion's Mane Edible Medicinal Mushroom Hericium erinaceus by Supplementation of Growth Hormones. International Journal of Medicinal Mushrooms, 26(11), 41–49.
8. DSMZ. Medium 129: Potato Dextrose Agar.
9. DSMZ. Medium 90: Malt Extract Peptone Agar.
10. Merck. Potato Dextrose Agar: Technical Data Sheet.
11. Wise K. (2006). Preparing Spread Plates Protocols. American Society for Microbiology.
12. Royse D. J., Wilkinson V. Care and handling of cultures of the cultivated mushroom (Agaricus bisporus). The Pennsylvania State University.
13. Burdsall H. H., Dorworth E. B. (1994). Preserving cultures of wood-decaying Basidiomycotina using sterile distilled water in cryovials. Mycologia, 86(2), 275–280.
14. Ryu S.-R. et al. (2011). Comparison of Viability in Basidiomycetes After Low Temperature Storage According to Storage Period. The Korean Journal of Mycology, 39(2), 141–144.
15. IBK Mushroom Culture Collection. Опис колекції Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України на GBIF.
16. Homolka L. (2014). Preservation of live cultures of basidiomycetes — recent methods. Fungal Biology, 118, 107–125.
17. Richter D. L. (2008). Revival of saprotrophic and mycorrhizal basidiomycete cultures after 20 years in cold storage in sterile water. Canadian Journal of Microbiology.
18. Homolka L., Lisá L. (2008). Long-term maintenance of fungal cultures on perlite in cryovials — an alternative for agar slants. Folia Microbiologica, 53, 534–536.
19. Humber R. A. (1997). Fungi: Preservation of cultures. In: Manual of Techniques in Insect Pathology. Academic Press, 269–279.
20. Homolka L. et al. (2010). Effect of long-term preservation of basidiomycetes on perlite in liquid nitrogen on their growth, morphological, enzymatic and genetic characteristics. Fungal Biology, 114, 929–935.
21. Richter D. L. et al. (2010). Comparison of effectiveness of wood decay fungi maintained by annual subculture on agar and stored in sterile water for 18 years. Canadian Journal of Microbiology.
22. DSMZ. Medium 130: Czapek-Dox Agar.
23. DSMZ. Medium 191: Corn Meal Agar.
24. HiMedia. Wort Agar M129.
25. Strain-specific features of Pleurotus ostreatus growth in vitro and some of its biological activities (2024). BMC Biotechnology.
26. Simply Horticulture. Agar guide.
27. Mycology Men. The Complete Guide: How to Make Agar at Home.
28. EZMushroom. Light Malt Extract (LME) Agar Recipe.
29. Mycologyst. Recipe: Black Agar — Activated Charcoal.
30. QIAGEN. Bacterial cultivation media and antibiotics.
31. Форуми грибників-аматорів: обговорення рецептів середовищ, позначені в таблицях додатка як «Форуми грибників».